細胞培養(yǎng)的過程和注意事項
一、準備工作
準備工作對開展細胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應(yīng)給予足夠的重視，準備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試，具體內(nèi)容可參閱有關(guān)文獻。
二、取材
在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞(視實驗?zāi)康亩?，經(jīng)過一定的處理(如消化分散細胞、分離等)后接入培養(yǎng)器皿中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。理論上講各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實際上幼體組織(尤其是胚胎組織)比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應(yīng)立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能馬上培養(yǎng)時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時應(yīng)嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。由組織并分離分散細胞的方法可參閱有關(guān)文獻。
三、培養(yǎng)
將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進行細胞計數(shù)，按要求以一定的量(以每毫升細胞數(shù)表示)接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細胞進入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細胞盡早進入生長狀態(tài)。正在培養(yǎng)中的細胞應(yīng)每隔一定時間觀察一次，觀察的內(nèi)容包括細胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿(由酚紅指示劑指示)，此外對培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時檢查。一般原代培養(yǎng)進入培養(yǎng)后有一段潛伏期(數(shù)小時到數(shù)十天不等)，在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細胞消化懸浮后分兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為"一代"。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性(Immortality)而無惡性。培養(yǎng)正在生長中的細胞是進行各種生物醫(yī)學實驗的良好材料。
四、凍存及復蘇
為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度--196℃，將細胞收集凍存管中加入含保護劑(一般為二甲亞砜或甘油)的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。復蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)。凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。
1、實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%乙醇擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風扇運轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70%ethanol擦拭無菌操作臺面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進行下一個細胞株的操作。
2、無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70%ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。
3、小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4、工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺(少ClassⅡ)。操作過程中，應(yīng)避免引起aerosol之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳針頭之傷害等。
5、定期檢測下列項目:5.1CO2鋼瓶之CO2壓力5.2CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。5.3.無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時/預(yù)濾網(wǎng)，3000小時/HEPA)。6.水槽可添加消毒劑(Zephrin1:750)，定期更換水槽的水
6、粉末培養(yǎng)基配制好后(加了血清)，一般在4度盡量不要超過1個月，如在-20度存放時間可長一些，但好也不要超過3-4個月，可能對于永生化細胞株來說要求不是太高，細胞嬌弱，放置時間不宜過長。
7、開紫外線照射臺的時候，就將培養(yǎng)基、酶、DHANKS液那到室外讓它自然升溫。這樣40分鐘后，溫度也升上來了。有很多人將其放到37度水浴鍋里加熱。一定要注意水浴鍋的衛(wèi)生，有的常年不清洗，里面很臟，容易在外面瓶身上吸附大量細菌。因此用時也一定要勤換水。從水浴鍋拿出后，好找個毛巾擦干上面的水。
